Pflanzenforschung • Zellbiologie

Forschungsbericht (importiert) 2007 - Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie

Neue Proteine zur Aktivierung molekularer Schalter in Pflanzen

Novel proteins for the activation of molecular switches in plants

Autoren

Berken, Antje; Fricke, Inka; Scrima, Andrea; Thomas, Christoph; Weyand, Michael; Wittinghofer, Alfred

Abteilungen

Emeritusgruppe (ehemals Abteilung für Strukturelle Biologie) (Prof. Dr. Alfred Wittinghofer)
MPI für molekulare Physiologie, Dortmund

Rho-Proteine regulieren als molekulare Schalter lebenswichtige Prozesse in Eukaryoten. Ihre Aktivierung ist essentiell für die Weiterleitung von multiplen internen und externen Signalen. Wissenschaftler am MPI in Dortmund haben kürzlich die verantwortlichen Aktivierungsproteine in Pflanzen identifiziert, die offenbar direkt an Zelloberflächenrezeptoren anknüpfen, sich strukturell deutlich von ihren Analoga in Tieren und Pilzen unterscheiden, aber dennoch einem generellen Reaktionsmechanismus folgen.
Rho-proteins act as molecular switches that regulate vital processes in eucaryotic organisms. Their activation is essential for the processing of multiple internal and external stimuli. Scientists at the MPI in Dortmund recently discovered the responsible activating proteins in plants, which apparently represent the direct link to signal perceiving cell surface receptors. Although these proteins differ significantly from their analogues in animals and fungi, they still follow a general reaction mechanism.

Das Leben einer Pflanze wird von sehr vielen unterschiedlichen Reizen aus ihrem Körperinneren sowie der Umgebung beeinflusst. Ein komplexes System zur Signalaufnahme registriert diese eigenen und fremden Signale und verarbeitet sie in biochemischen Reaktionsketten, die das ursprüngliche Signal kaskadenartig weiterleiten, hochgradig verstärken und schließlich ganz spezifische Reaktionen in einer Zelle auslösen. Als Kontrollpunkte dienen in vielen Signalwegen der Pflanze kleine GTP (Guanosintriphosphat)-bindende Eiweißmoleküle der Rho-Familie, die ROP-Proteine, die als molekulare Schalter die Signalübertragung vermitteln [1].

GTP-bindende Rho-Proteine als molekulare Schalter

Ähnliche Schalterproteine kennt man auch von Tieren und Pilzen. Diese Rho-Proteine sind eine Untergruppe der Ras-Superfamilie kleiner GTP-bindender Proteine (G-Proteine), die eine Vielzahl von physiologischen Prozessen beeinflussen [2]. Ihre Schalterfunktion beruht darauf, dass entweder das Nukleotid GDP (Guanosindiphosphat) oder GTP an sie gebunden ist. Im GDP-gebundenen Zustand sind die Proteine inaktiv. Im GTP-gebundenen, aktiven Zustand binden sie an Effektorproteine und leiten auf diese Weise die Signale weiter. Der Übergang zwischen dem inaktiven und dem aktiven Zustand wird durch regulatorische Proteine kontrolliert, die direkt und spezifisch mit den kleinen G-Proteinen wechselwirken. Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) bewirken als positive Regulatoren die Freisetzung von GDP, erleichtern dadurch die Bindung von GTP und aktivieren somit die G-Proteine. Die Spaltung von GTP zu GDP erfolgt durch die intrinsische GTPase-Aktivität der kleinen G-Proteine, bedarf jedoch einer Katalyse durch GTPase-aktivierende Proteine (GAPs), die somit als negative Regulatoren das Schalterprotein inaktivieren.

Vielfache Untersuchungen der letzten Jahre haben gezeigt, dass die pflanzlichen Rho-Proteine, die ROPs (Rho of plants), eine zentrale Rolle in zahlreichen physiologischen Prozessen spielen, indem sie das pflanzliche Wachstum und die Entwicklung beeinflussen, die Befruchtung steuern und die Reaktionen der Pflanze auf diverse Umwelt- und Stressfaktoren (z. B. Schädlingsbefall) kontrollieren [1]. Die dabei auf die Pflanze einwirkenden Signale werden häufig durch Rezeptorproteine an der Zelloberfläche wahrgenommen und in das Zellinnere übermittelt. Diese Signale können dort jedoch nur dann einen Effekt bewirken, wenn der molekulare Schalter durch GEF-Proteine betätigt, also aktiviert wird. Lange Zeit war jedoch völlig unklar, wie die ROP-Proteine aktiviert werden, da in Pflanzen die notwendigen Austauschfaktoren für ROPs nicht bekannt waren.

Neue Austauschfaktoren zur Aktivierung der ROP-Proteine in Pflanzen

Die Dortmunder Max-Planck-Forscher haben kürzlich das Rätsel der ROP-Aktivierung gelöst und eine neue Familie von Proteinen in Pflanzen identifiziert, die als ROP-spezifische Austauschfaktoren (RopGEFs) funktionieren [3].

Obwohl G-Proteine und ihre Regulatoren im Allgemeinen als konserviert gelten, das heißt homologe Proteine in Tieren, Pilzen und Pflanzen zu finden sind, weisen die pflanzlichen RopGEFs mit ihrer für GEF-Proteine ungewöhnlichen funktionellen Einheit, der katalytisch aktiven so genannten PRONE-Domäne, interessanterweise keinerlei Übereinstimmung mit Proteinen aus den anderen Reichen höherer Organismen auf. Ihnen gegenüber stehen die in ihrer Aminosäureabfolge völlig verschiedenen RhoGEFs der Tiere und Pilze, die wiederum keine Entsprechung im Pflanzenreich finden. Diese Tatsache lässt die Dortmunder Arbeitsgruppen um Alfred Wittinghofer und Antje Berken vermuten, dass sich die GEFs als Aktivatoren für die Rho-Familie kleiner GTPasen während der Evolution als „späte Erfindung“ erst nach der Trennung des Pflanzenreichs von Pilzen und Tieren entwickelt haben.

Bei weiteren Vergleichen dieser neuen RopGEFs mit Datenbankeinträgen stellten die Wissenschaftler fest, dass einige Vertreter dieser Proteinfamilie direkt an membranständige Rezeptorproteine binden, die die RopGEFs möglicherweise zur Zellmembran rekrutieren und in ihrer Funktion als Kinasen eventuell deren Aktivität über Phosphorylierungsreaktionen steuern. Die Forscher aus Dortmund schlagen für ROP-abhängige Prozesse in Pflanzen eine geschlossene Reaktionskette vor, in der eingehende Signale über solche Rezeptorproteine in der Zellmembran registriert und an RopGEFs weitergeleitet werden. Diese aktivieren ihrerseits das Schalterprotein ROP und setzen auf diese Weise über Effektormoleküle multiple Signalketten in Gang, und zwar so lange, bis die RopGAPs den Schalter in den inaktiven Zustand zurückversetzen (Abb. 1).

Modell zur pflanzlichen Signalübertragung durch ROP-Proteine. Auf die Zelle einwirkende Signale werden über Rezeptoren in der Zellmembran an Guaninnuk Bild vergrößern
Modell zur pflanzlichen Signalübertragung durch ROP-Proteine. Auf die Zelle einwirkende Signale werden über Rezeptoren in der Zellmembran an Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (RopGEFs) weitergeleitet. Diese stimulieren den Austausch von GDP gegen GTP bei den ROP-Proteinen und überführen diese dadurch in den aktiven Zustand. Aktive ROP-Moleküle wiederum interagieren mit Effektoren, die zahlreiche Lebensprozesse der Pflanze beeinflussen. Die Inaktivierung der ROPs durch GTP-Hydrolyse wird von RopGAP-Proteinen katalysiert. Im Hintergrund ist eine Blüte der Pflanze Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand) zu sehen, die den Dortmunder Forschern als Modellorganismus für die Isolierung der ersten pflanzlichen RopGEFs diente. [weniger]

Struktur-Funktionsbeziehungen bei der RopGEF-Katalyse

Im weiteren Verlauf der Arbeiten mit den neuen RopGEFs der Pflanzen ist es dem Dortmunder Team aus Biologen, Biochemikern und Kristallographen vor kurzem ebenfalls gelungen, die katalytisch aktive PRONE-Domäne eines RopGEFs (RopGEF8) aus Arabidopsis thaliana sowohl allein als auch im Proteinkomplex mit einem ROP-Protein (ROP4) zu kristallisieren und die dreidimensionalen Strukturen röntgenkristallographisch zu bestimmen [4, 5].

Dabei zeigte sich, dass die RopGEF-Domäne (PRONE8) eine völlig neuartige Raumstruktur aus zwei Subdomänen einnimmt und über Wechselwirkungen zwischen hydrophoben Aminosäuren im Bereich der Helices α1 und der darauf folgenden Schleifenstrukturen ein schmetterlingsförmiges Dimer aus zwei Molekülen bildet (Abb. 2). Die funktionelle Bedeutung dieses Dimers konnten die Wissenschaftler durch biochemische Charakterisierung von mutierten PRONE8-Proteinen mit Aminosäureaustauschen in der Dimer-Kontaktfläche nachweisen. Die Ausbildung eines katalytisch aktiven Dimers ist eine Besonderheit der pflanzlichen RopGEFs. Alle bekannten, strukturell jedoch völlig verschiedenen GEF-Domänen aus Tieren oder Pilzen funktionieren dagegen als Monomere.

Schmetterlingsförmige 3D-Struktur eines Dimers der katalytischen PRONE-Domäne von RopGEF8 aus Arabidopsis thaliana. Die beiden Untereinheiten (jeweils Bild vergrößern
Schmetterlingsförmige 3D-Struktur eines Dimers der katalytischen PRONE-Domäne von RopGEF8 aus Arabidopsis thaliana. Die beiden Untereinheiten (jeweils blau und grün) werden in zwei Subdomänen 1 und 2 unterteilt (links) und wechselwirken miteinander über hydrophobe Aminosäuren in der Dimerisierungsfläche (Vergrößerung rechts). [weniger]

Weitere entscheidende Einblicke in die Funktion der pflanzlichen RopGEFs erhielten die Forscher bei der Analyse der Struktur des Proteinkomplexes aus PRONE8 und ROP4 (Abb. 3). Im Komplex bindet das PRONE8-Dimer zwei ROP4-Moleküle. Dabei fällt in der fast ausschließlich aus α-Helices bestehenden PRONE-Domäne ein Element aus β-Strängen auf, das in der unkomplexierten Struktur zuvor nicht sichtbar war. Dieser so genannte β-Arm einer PRONE8-Untereinheit umschließt jeweils ein auf der gegenüberliegenden Seite von der zweiten PRONE8-Untereinheit gebundenes ROP-Molekül. Eine derartige strukturelle Anordnung erklärt, warum eine Dimerisierung für die RopGEF-Aktivität unerlässlich ist. Eine weitere Besonderheit in dieser Struktur ist die Anwesenheit des Nukleotids GDP im ROP-Protein, was bislang noch nie direkt in Komplexen aus kleinen G-Proteinen und GEF-Domänen beobachtet werden konnte. Stabile G-Protein-GEF-Komplexe bilden sich im Allgemeinen erst nach Freisetzung des Nukleotids aus. Das Forscherteam aus Dortmund nimmt daher an, dass der erfasste GDP-enthaltende Proteinkomplex einen kurzlebigen Übergangszustand im Reaktionsmechanismus der GEF-Katalyse darstellt.

3D-Struktur des Proteinkomplexes aus der katalytischen PRONE-Domäne  von RopGEF8 (PRONE8) und ROP4 aus Arabidopsis thaliana. Die ROP-Moleküle (grün) e Bild vergrößern
3D-Struktur des Proteinkomplexes aus der katalytischen PRONE-Domäne von RopGEF8 (PRONE8) und ROP4 aus Arabidopsis thaliana. Die ROP-Moleküle (grün) enthalten das Nukleotid GDP und werden jeweils von beiden PRONE8-Untereinheiten (blau bzw. beige und magenta für Subdomäne 1 und 2) kontaktiert. [weniger]

Die weitere Analyse der Struktur dieses Übergangszustands ermöglichte den Wissenschaftlern am MPI für molekulare Physiologie, wichtige mechanistische Einzelheiten der GEF-vermittelten Nukleotidfreisetzung näher aufzuklären. Dabei wurde deutlich, dass die Interaktion mit der GEF-Domäne strukturelle Veränderungen in hoch konservierten Regionen des ROP-Proteins induziert, die die Wechselwirkungen zwischen G-Protein und Nukleotid schwächen (Abb. 4). Im späteren Verlauf der Katalyse bewirken die weiter fortgeschrittenen Umlagerungen im G-Protein dann offenbar die endgültige Freisetzung des Nukleotids.

Da vergleichbare Restrukturierungen auch in nukleotidfreien Proteinkomplexen zwischen kleinen G-Proteinen aus Tieren und deren strukturell jedoch andersartigen GEFs beobachtet wurden, vermuten die Forscher des Max-Planck-Instituts, dass der beobachtete Übergangszustand bei allen GEF-katalysierten Reaktionen kleiner G-Proteine auftritt und der Nukleotidaustausch nach einem allgemein gültigen Reaktionsmechanismus abläuft.

Modell zum Reaktionsmechanismus für die GEF-katalysierte Nukleotidfreisetzung. Die GEF-induzierten Restrukturierungen konservierter Regionen im G-Prot Bild vergrößern
Modell zum Reaktionsmechanismus für die GEF-katalysierte Nukleotidfreisetzung. Die GEF-induzierten Restrukturierungen konservierter Regionen im G-Protein (gelb) schwächen zunächst die Bindung von GDP (orange), indem die Wechselwirkung zwischen einem essentiellen Lysinrest im P-loop des G-Proteins und der β-Phosphatgruppe des Nukleotids durch eine Interaktion mit einem konservierten Glutamat der switch II-Region ersetzt wird. Gleichzeitig kommt es zu Abstoßungsreaktionen zwischen den negativen Ladungen von Glutamat und β-Phosphat, während Mg2+ aus der Nukleotid-Bindetasche verdrängt wird. Eine zusätzliche Bewegung der switchI-Region weitet die Bindetasche auf und ermöglicht die Dissoziation des Nukleotids. [weniger]

Originalveröffentlichungen

1.
Berken, A.:
ROPs in the spotlight of plant signal transduction.
2.
Jaffe, A. B.; Hall, A.:
Rho GTPases: Biochemistry and Biology.
3.
Berken, A.; Thomas, C.; Wittinghofer, A.:
A new family of RhoGEFs activates the ROP molecular switch in plants.
4.
Thomas, C.; Weyand, M.; Wittinghofer, A.; Berken, A.:
Purification and crystallization of the catalytic PRONE domain of RopGEF8 and its complex with ROP4 from Arabidopsis thaliana.
5.
Thomas, C.; Fricke, I.; Scrima, A.; Berken, A.; Wittinghofer, A.:
Structural evidence for a common intermediate in small G protein-GEF reactions.
 
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