Elektronenmikroskopie
Die Kryo-Elektronenmikroskope unseres Instituts sind mit diesen neuen Direkt-Elektronen-Detektoren ausgestattet und erlauben die hochauflösende Untersuchung von kryofixierten Proteinen, Proteinkomplexen und zellulären Strukturen in ihrem natürlichen Zustand.
Diese hohen Auflösungen sind nur mit Hilfe der sogenannten Kryofixierung erreichbar. Bei dieser Methode werden die biologischen Proben innerhalb weniger Millisekunden eingefroren. Durch diese hohe Einfriergeschwindigkeit wird die Bildung von Eiskristallen verhindert und die Probe kann anschließend in nahezu natürlichem Zustand im Kryo-Elektronenmikroskop bei -196˚C untersucht werden.
Zur Durchführung der Kryofixierung und der nachfolgenden Probenaufarbeitung stehen u.a. ein Gatan Kryoplunger Cp3, ein FEI Vitrobot Kryoplunger, eine Leica EM HPM100 Hochdruckgefrieranlage und eine Leica EM AFS2 Gefriersubstitutionsanlage zur Verfügung. Ein Leica EM FC6 Kryo-Ultramikrotom ermöglicht darüber hinaus die Herstellung von vitrifizierten Kryo-Schnitten.
Für die Untersuchung der Kryoproben steht seit Ende 2015 das High-End Gerät FEI Titan Krios zur Verfügung. Dieses 300kV Kryo-Elektronenmikroskop ist mit einem Korrektor für sphärische Aberrationen (Cs-Korrektor) und einer Volta-Phasenplatte (VPP) ausgerüstet, eine spezielle Feldemissionskathode (X-FEG) sorgt für eine höhere Strahlintensität bei verbesserter Energiebreite. Als Direkt-Elektronen-Detektoren stehen uns sowohl eine FEI Falcon III als auch eine Gatan K2 Kamera (mit Gatan Quantum LS Energiefilter) zur Verfügung. Mit spezieller Software (FEI EPU) wird eine automatisierte Datenaufnahme rund um die Uhr möglich.
Als zweites 300kV Kryo-Elektronenmikroskop steht ein JEOL JEM 3200FSC mit Feldemissionskathode, in-column -Energiefilter und einer TVIPS F416 4K-Kamera bereit um Hochauflösungsbilder zu erstellen. Zwei 120kV Elektronenmikroskope (JEOL JEM1400 und FEI Tecnai Spirit) werden verwendet um die Qualität der Proben mittels Negative-Stain-Methode zu beurteilen. Mit diesen Instrumenten können mittels spezieller Probenhalter (Gatan 626) auch Kryoproben bei geringerer Auflösung untersucht werden. Diese Elektronenmikroskope sind jeweils mit einer TVIPS F416 4K-Kameras ausgerüstet.
Neben den hochauflösenden Kryo-Techniken bietet die Zentrale Einheit auch ein breites Spektrum klassischer elektronenmikroskopischer Methoden an. Zum Beispiel werden chemisch fixierte Proben (Zellorganellen, Zellen, Gewebe etc.) in Epoxidharz (Epon) eingebettet und mit einem Ultramikrotom Ultradünnschnitte hergestellt. Sollen spezifisch Proteine in diesen Ultradünnschnitten nachgewiesen werden ist dies mit der Diaminobenzidin (DAB)-Photobleaching–Methode möglich: Mit GFP markierte Proteine werden korrelativ zunächst im Fluoreszenz-Lichtmikroskop untersucht und dann im Elektronenmikroskop als elektronendichtes DAB-Präzipitat nachgewiesen. Dieses DAB-Präzipitat entsteht nach Photobleaching spezifisch im Bereich der GFP-markierten Proteine und ermöglicht die Lokalisation des Proteins mit hoher Auflösung im zellulären Umfeld.
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